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拟南芥雌蕊端自交不亲和显性抑制因子的平行进化

今天分享一篇来自nature communications三月份的文章：Parallel evolution of dominant pistil-side self-incompatibility suppressors in Arabidopsis
Abstract：
自交是被子植物中常见的一种进化趋势，也是研究适应性进化递归模式的合适模型。而许多植物可通过被称为自交不亲和性(SI)的生理过程来避免自体受精。在十字花科植物中，雄性配体SP11/SCR和雌性受体激酶SRK之间的直接和特异性相互作用是SI反应所必需的。尽管拟南芥通过丢失这些基因获得了自体受精，但分子进化导致的自交亲和等位基因的传播尚需进一步研究。我们在此表明，拟南芥中，显性的SRK沉默基因至少进化了两次。在Col-0和C24生态型残遗的SRK区域均发现了不同的反向重复序列。而这两种反向重复序列对功能性SRK序列的抑制作用都是显性的，但靶标特异性不同。这些SI显性抑制因子可能有助于拟南芥自交亲和性的快速固定。
Introduction：
自交不亲和(SI)是指超过40%的开花植物物种采用的防止自交和促进不同个体间异交的机制。在十字花科植物中，SI由两个复等位基因控制：S位点蛋白11 (SP11；也被称为S位点富含半胱氨酸蛋白，SCR和S位点受体激酶(SRK)。SP11/SCR是定位于花粉被膜表面的一种多肽，而SRK是柱头表面的受体。从SP11/SCR和SRK紧密连锁的基因对（单倍型）翻译的蛋白直接且特异性地彼此结合，从而在柱头上触发自我花粉排斥信号。
另一方面，自交亲和性进化是植物中最常见的趋同进化之一。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，SC被认为至少独立进化了三次，因为三个主要的单倍群(A、B和C)是从一个更大的分支S单倍型集合中衍生出来的，而这些单倍型都是在一些密切相关的异交种中发现的，比如A. halleri。之前的一项研究进一步将等位基因分为12个单倍型。Col-0、Uk-3和Wei-1等生态型属于单倍群A，其中Col-0携带一个伪SRK和一个非功能性SP11/SCR基因，而Uk-3和Wei-1携带功能性SRK基因。SP11/SCR的倒置被认为是破坏该单倍群SI表型的主要突变。Cvi-0生态型属于单倍群B，且在SRK 9中发现了一个提前终止密码子。C24等株系属于A和C单倍群重组形成的R2单倍型，其中SRKA和SRKC均大量缺失。尽管存在这些事实，但分子水平上导致SC在该物种中传播的推动力仍然需要了解。
最近，一些实验室已报道的观察结果，为该问题提供了支持。虽然已知所有的拟南芥生态型都是自交亲和的，但当有功能的SP11/SCR和/或SRK被转入时，SI系统可以在该物种中被重建。这些发现表明，至少在某些生态型中，仍然保留了表达SI所需的非S基因座成分；然而，对于表现雌性SI表型的遗传因素一直存在争议。当Col-0生态型用Sb-单倍型转化时，其中SRKb和SCRb基因均来自于A. lyrata（对应于等位基因SRK20），转基因株系仅表现出微弱或瞬间SI表型。这种短暂的SI表型在花期13阶段（即开花期）在柱头上很明显，但在后期减弱。但另一方面，当其他A. thaliana生态型（如C24）与相同的基因发生转化时，无论花期如何，都表现出稳定且强烈的SI表型。据Liu et al报道，这种表型变异是由和S位点紧密连锁的PUB8基因的自然变异所导致，其编码了一个包含ARM-repeat U-box蛋白。相比之下，Indoriolo et al报道了另一种包含ARM-repeat U-box的蛋白ARC1，其对于Col-0和Sha生态型中SI的强烈表达是必须的。且ARC1参与了十字花科植物SI的表达，而在该属的许多自交亲和物种中，ARC1基因却已被独立地删除。然而，这些报道之间的差异还尚未得到解决。在拟南芥中决定SI重建的先决条件直接关系到解决SC在该物种中是如何进化的问题。
通过这项研究，鉴定Col-0和C24之间差异的过程，我们发现在Col-0生态型中SRKA残遗区域有一个反向重复序列（SRKIRCol-0），它通过不同的单倍型抑制了SRK的mRNA积累。SRKIRCol-0可能产生的小RNA的干扰可以解释该株系中重建SI表型的不稳定性。此外，我们在C24（SRKIRC24）中发现了一个独特的反向重复序列，它也可能抑制等位基因SRK的表达，但其靶标特异性不同于SRKIRCol-0。这两种序列结构在拟南芥中独立进化，我们讨论了这些显性抑制因子在拟南芥SC固定中的可能作用。我们的研究结果也支持这样的观点，即反向重复是等位基因显性的一种周期性进化形式。
Results：
Col-0株系可能携带有SRK mRNA的主要抑制因子
为了证实Col-0中SI表型的不稳定性，我们构建了一个携带SRKb和SCRb的转基因株系，它们是从A. lyrata Sb (S20) 单倍型（Col-0?+?SRKb-SCRb）中克隆得到的。在之前的研究中，我们构建了携带SRKb和SCRb单拷贝的C24转基因株系（简便起见，在本研究中称为SI-C24）。SI-C24在花期13和14阶段都显示出SI表型（Supplementary Fig. 1）。在花期13阶段，Col-0?+?SRKb-SCRb的雌蕊只能部分拒绝SI-C24的花粉，而在花期14阶段，则不能（Supplementary Fig. 1）。这些观察结果与Nasrallah等人先前的结果一致。
当以Col-0?+?SRKb-SCRb的花粉作为花期14阶段SI-C24雌蕊的花粉供体时，实际上并未观察到花粉管的生长（Fig. 1a, b）。因此，Col-0能够表达SCRb基因并显示SI表型的雄性一面，却不能表现SI表型的雌性一面。SI-C24和Col-0的F1代在花期14没有表现出很强的雌性SI表型（Fig. 1b），并且SRKb的mRNA水平显著降低（Fig. 1c）。因此，我们假设Col-0携带一种占主导地位的内源性因子，它并不存在于C24中，且能抑制SRKb的表达。这与Liu等先前研究报道的弱SI表达表型为隐形的结果不一致。
拟南芥雌蕊端自交不亲和显性抑制因子的平行进化
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Fig. 1 SRKIRCol-0可能产生小RNA
Col-0携带属于A单倍群残遗的S基因座序列（At4g21370：ψSRKA）。在保存的拟南芥信息资源（TAIR）可用的基因组信息中，我们在Col-0的ψSRKA等位基因内发现了反向重复结构，并将其命名为SRKIRCol-0。SRKIRCol-0由一个502bp的反向重复序列组成，该序列对应于来自A. halleri S4单倍型的直系同源SRK序列中编码SRK激酶结构域的片段（Fig. 1d）。这样的发夹RNA序列可以形成双链RNA，并且可以被Dicers加工成小RNA。我们怀疑SRKIRCol-0是小RNA的来源，而这些小RNA可以起到抑制引入的SRKb表达的作用。与此假设相符，转录组分析显示来自于Col-0柱头上25671条小RNA reads mapping到了SRKIRCol-0区域（Fig. 1e, Supplementary Fig. 2a）。并且超过99.5%的reads（25563）被特异性地mapping到SRKIRCol-0区域；因此，我们认为这些小RNA可能是由这种发夹产生的。这些小RNA大多数长度为20或21个核苷酸（Supplementary Fig. 2b）。SRKIRCol-0与SRKb中编码SRK激酶结构域的DNA序列高度同源。尤其是，SRKIRCol-0序列中102bp-253bp之间的片段与SRKb基因相应区间的一致性高达89.0%（Supplementary Fig. 3）。我们使用psRNAtarget程序来预测mapping到SRKIRCol-0的这些小RNA是否可以靶向SRKb。结果显示，在SRKb的激酶结构域中有58个非冗余reads完全匹配（psRNAtarget程序中的期望值=0）（Supplementary Fig. 4），表明在SRKIRCol-0序列中发现的这些小RNA可能潜在地靶向SRKb。
SRKIRCol-0以显性方式抑制SRKb的表达
为了证明SRKIRCol-0是否能抑制SRKb，我们将一个包含SRKIRCol-0序列（完整SRKIRCol-0序列）的5353bp的基因组片段转入到SI-C24株系中（Fig. 2a）。先前的研究中，我们表明，ψSRKA的启动子在柱头上被激活转录。结果，花期14阶段在SI-C24株系中观察到的SI表型在转化株中受损（Fig. 2b-2d）。该观察结果进一步表明，SRKIRCol-0序列可以以显性方式抑制SRKb。而当我们仅转入包含SRKIRCol-0序列的第一个重复序列的部分片段（部分SRKIRCol-0）时，该片段无法抑制SRKb的功能（Fig. 2b-2d）。
我们还研究了在SRKIRCol-0中插入T-DNA的影响。与未携带T-DNA插入的个体（-/-）相比，纯和T-DNA插入的系（+/+）恢复了SRKb mRNA的积累（Supplementary Fig. 5b）。这些结果表明，SRKIRCol-0可能需要连续的反向重复序列来在打破SI中发挥作用。综上所述，我们表明完整的SRKIRCol-0是必要的，并且可能足以导致C24背景中SI的破坏。
SRKIRCol-0抑制内源性SRK的表达
接下来，我们测试了SRKIRCol-0序列是否可以抑制内源性SRKb基因的表达。为了实现这一目标，我们构建了A. thaliana和A. lyrata（琴叶拟南芥）的种间杂交种。我们将A. thaliana Col-0和C24生态型与A.lyrata（琴叶拟南芥）携带Sa（intermediate dominance class）和Sb（most dominant class）单倍型的个体杂交。结果表明，携带来自A.lyrata亲本Sb等位基因及来自A.thaliana亲本的C24基因型的雌蕊，与A.lyrata中SaSb个体的花粉不亲和（Fig. 3a，3b）。值得注意的是，A.lyrata中SaSb的花粉仅表现出Sb特异性，因为对于SCR的表达Sb优于Sa。相比之下，携带来自A.lyrata中Sb等位基因的雌蕊与来自A.thaliana中Col-0基因型的雌蕊，能够亲和SaSb的花粉（Fig. 3a，3b）。我们还发现，与A.lyrata中SaSb相比，Col-0/Sb柱头中SRKb的mRNA水平减少了6.5倍，而在C24/Sb的柱头里则并非如此（Fig. 3c）。因此，在Col-0遗传背景的柱头中，SRKb的表达受到了抑制。
在一些拟南芥株系中，包括Uk-3和Wei-1，其中SRK的功能得以保留。两种株系均携带一个完整的SRK基因，该基因属于单倍群A（SRKA），而Wei-1可以拒绝携带SCRA的A.lyrata的花粉。Cvi-0株系中SRK序列属于B单倍群，它是一个假基因（ψSRKBCvi-0），但可在花中转录。我们预计在SRKIRCol-0存在的情况下，这些株系中SRK基因的表达将被抑制，因为它们与SRKIRCol-0的序列具有高度的一致性（Supplementary Fig. 6）。psRNAtarget程序还预测，在SRKIRCol-0序列内发现的1023个小RNA reads和91个非冗余小RNA reads均完美匹配到SRKAWei-1和ψSRKBCvi-0的激酶结构域内（Supplementary Fig. 4）。为了验证这一发现，我们将这些株系与Col-0杂交，并分析F1代中SRK的mRNA水平。与SI-C24 × Col-0中F1代类似（Fig. 1c），同杂交种中预期的转录本积累水平相比，SRK在Uk-3 × Col-0、Wei-1 × Col-0以及Cvi-0 × Col-0 F1代中的表达显著降低（Fig. 3d，e）。这一结果表明在SRK的抑制上，SRKIRCol-0具有广泛的功能。
拟南芥雌蕊端自交不亲和显性抑制因子的平行进化
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Fig. 2 C24的S基因座中具有反向重复结构
由于C24可以成功表达外部转入的SRKb（Fig. 1），与亲本株系Uk-3、Wei-1及Cvi-0相比，Uk-3 × Col-0、Wei-1 × Col-0及Cvi-0 × Col-0 F1代中，SRK mRNA水平的降低是出乎意料的（Fig. 3d，e）。C24携带属于R2单倍型的残遗S基因座，具有SRKA和SRKC的小片段。我们重新检查了先前研究报道的C24中携带残遗S位点的细菌人工染色体序列，并在伪SRKA区域发现了一个434bp的反向重复序列（Supplementary Fig. 7a），我们将其命名为SRKIRC24。使用公开的C24株系小RNA转录组数据集，我们在花蕾中检测到3235条mapping到SRKIRC24序列中的reads（Supplementary Fig. 7b）。SRKIRC24与SRKAWei-1具有99.7%的序列一致性，与ψSRKBCvi-0具有84.4%的序列一致性（Supplementary Fig. 8）。另一方面，SRKIRC24和SRKb之间的DNA序列一致性被限制在73.1%。psRNAtarget预测发现，在SRKIRC24中检测到的329个小RNA reads及20个非冗余小RNA reads分别与SRKAWei-1和ψSRKBCvi-0的激酶结构域完全匹配（Supplementary Fig. 4）。相反，这些reads中没有一个与SRKb完全匹配（Supplementary Fig. 4a），表明这些小RNA可能并不靶向SRKb。这一发现与我们的实验结果一致，表明SRKb可以在C24背景下稳定表达（Fig. 1）。
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Fig. 3 【拟南芥雌蕊端自交不亲和显性抑制因子的平行进化】SRKIRCol-0不抑制被密码子取代的SRKb
以上研究表明，基于序列互补的小RNA沉默途径参与了Col-0中SRKb的抑制。为此，在不改变蛋白序列的情况下，我们在编码激酶结构域（synSRKb）的序列中生成了具有同义替换的合成SRKb序列，并将合成的SRKb序列转入Col-0中（Fig. 4a）。与原来SRKb（其与SRKIRCol-0具有89.0%的序列一致性）相比，synSRKb和SRKIRCol-0之间的序列相似性仅为66.6%（Supplementary Fig. 3）。在synSRKb中，同义替换几乎完全消除了在SRKIRCol-0中发现的小RNA的预期靶向性（Supplementary Fig. 4）。我们假设这种降低的靶向性会降低沉默的可能性。携带synSRKb序列的品系表现出与SI-C24类似强度的SI表型（Fig. 4b，c）。不同于那些被本体SRKb基因转化的品系，这些品系中SRKb mRNA的水平并没有受到抑制（Fig. 4d）。这些结果表明，SRKIRCol-0对SRKb的抑制作用需要靶标和产生的小RNA之间具有序列同源性。
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Fig. 4 Discussion：
在本研究中，我们探讨了拟南芥的S基因座中反向重复序列对SRK mRNA积累的抑制作用。我们发现，SRKIRCol-0可以直接抑制转入的SRKb基因mRNA的积累，并且这种转录本丰度的降低可能解释了Col-0株系中SI表型的弱重构。从ψSRKA的启动子在柱头上被激活转录的发现来看，这种反向重复很可能被RNA聚合酶 II 转录，这是天然存在的发夹RNA的特征。SRKIRCol-0的RNA结构可能是通过Drosophila中先前描述的天然发夹RNA的途径加工成小RNA的。但这需要进一步的研究来了解SRKIRCol-0是如何产生小RNA的。
此外，我们还注意到在C24株系的残遗S位点上存在一个反向重复结构SRKIRC24。与SRKIRCol-0的情况类似，SRKIRC24可能以显性方式直接抑制同源SRK序列的mRNA积累。SRKIRCol-0能够抑制本研究中所有的SRK等位基因，而SRKIRC24却不能抑制SRKb，这可能是由于SRKIRC24反向结构的位置。SRKIRCol-0对应于编码激酶结构域的一个片段，其在SRK序列中相对保守。SRKIRC24位于可变结构域外部，表明该结构可能不具有大范围抑制多样SRK的能力。基于这些结果，我们认为，当SRK等位基因转入到Col-0或C24中时，其功能的表达在计算层面上是可以预测的。
根据先前的研究，A1、R0、R1单倍型和A2、R2单倍型间SRKA区域的序列结构在很大程度上是共通的。基于对1083个株系的S位点序列的调查，我们粗略估计，约有80.3%的A.thaliana株系（A1、A2、R0、R1和R2单倍型的总和）携带这两种反向重复序列中的一种（SRKIRCol-0或SRKIRC24）。几项研究表明，拟南芥中A单倍型自交亲和性进化的最初步骤是SP11/SCR基因功能的丧失，因为该基因的功能形式在所有被研究的株系中都不存在。
占主导作用的SRK抑制因子是否在拟南芥SC的进化中发挥作用是一个有趣的问题。在芸苔属中，显性等位基因中与S位点连锁的小非编码RNA，沉默了隐形SP11/SCR基因mRNA的表达。类似的，在A. lyrata和A. halleri等物种中也预测了几个SP11/SCR的主导类别。进一步对A.halleri系统的研究发现，在该区域至少有17个小RNA产生位点，这有助于优势关系的建立。有人认为，当SC占优势时，优势S单倍群中SP11/SCR的基因阻断突变比隐形突变更有可能传播。在某些气候条件下，如花粉有效性受限的冰川时期，这种显性的SRK抑制突变可能比隐形突变更快地在种群中传播。利用现有的理论框架，结合等位基因显性效应对SC的进化进行更多的理论研究是值得的。
SRKIRCol-0或SRKIRC24在拟南芥的进化过程中独立进化了两次，这一事实让人想起了一种显性表型扩散的经典例子：工业革命期间白桦尺娥（Biston betularia）的黑色素化。在黑色素表型占主导地位的其他颜色类型，在这个物种中也独立进化了两次。我们的结果支持该模型，即反向重复是建立等位基因优势关系的简便方法。反向重复结构也许可以解释其他显性隐性遗传系统。
以上
参考：
Fujii, S., Shimosato-Asano, H., Kakita, M. et al. Parallel evolution of dominant pistil-side self-incompatibility suppressors in Arabidopsis. Nat Commun 11, 1404 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-15212-0

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