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做标准曲线的12个经典问题 校准曲线

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校准曲线（做标准曲线的12个经典问题）
1、标准曲线的制作依据？
GB/T22554-2010《基于标准样品的线性校准》中：
1）标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围；
2）标准样品的组分尽量与被测样品组分一致；
3）标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围；
4）标准样品的个数至少应有3个浓度；
5）每个标准点至少重复2次 ， 这个重复是指从稀释开始；
如果国家标准有相应的浓度系列推荐 ， 尽量按国家标准 。工作中我们经常采用线性校准 ， 因为线性方程最为简洁 。
2、什么是校准曲线？
校准曲线包括标准曲线和工作曲线 ， 前者用标准溶液系列直接测量 ， 没有经过预处理过程 ， 这对于样品往往造成较大误差；而后者所使用的标准溶液经过了与样品相同的消解、净化、测量等全过程 。
3、首先标曲要做几个点？
标准曲线需要几个数据点 ， 是由所检测组分的浓度范围、分析仪响应特性、干扰因素、浓度与检测信号响应类型有关的 。
3个点：对于一些低浓度 ， 特别是微量分析 ， 并且浓度范围不是很大的 ， 检测器响应可靠 ， 背景干扰非常小的 ， 则可以选用较少的工作点就行 ， 一般有3个浓度点就足够了 ， 有些甚至可以只用一个浓度点就行 ， 另一个点直接用坐标原点 。
4~6个点：对于平时测量的样品浓度范围较宽 ， 并且检测器响应不完全是一次曲线（直线）的 ， 可以采用二次曲线或分段校正方式 ， 以减少数据偏差 ， 这种情况就需要多用几个数据点 ， 如果不分段 ， 数据点有4~6个就够用 。
至少两个点：但如果是分段校正 ， 则每段需要至少两个数据点 。而对于一些样品无浓度范围规律的 ， 特别是一些检测机构 ， 如果分析仪的检测响应可靠 ， 环境因素影响少的 ， 可以做校正曲线 。若是环境因素影响大的 ， 则不必做校正曲线 ， 而采用标准加入法或标准加入-一次稀释法反而简便一些 。
实际上 ， 我们一般是做五个点（不包括零浓度）；一般以检出限的5~10倍为第一个点 ， 以后根据1倍递增 ， 最高浓度是最低浓度的10~20倍为宜（理化分析实验为例） 。当然 ， 要根据仪器的灵敏度来调整 。
4、标曲R值是几个9才合格？
实验室应按检测标准（方法）的要求使用标准溶液或标准物质建立标准曲线 。所用标准溶液或标准物质应覆盖被测样品的浓度范围 。检测标准（方法）如无具体的要求 ， 至少使用5个标样（除空白外）建立线性标准曲线 ， 每个点重复测定1-3次 ， 对于筛选方法 ， 线性回归方程的相关系数不应低于0.98 ， 对于确证方法 ， 相关系数不应低于0.99 。
其实 ， 大于0.99是判断是否为线性相关的一个标准 ， 实际应用中线性大于0.999才是比较理想的 。线性在0.99到0.999之间的监测结果只用接近最高浓度一半（中间浓度）的位置才比较准确 ， 如果线性大于0.999的话 ， 在整个线性范围内都会有一个比较满意的结果 。
如果检测的线性不好 ， 可以减少标准的覆盖范围 ， 将标准的浓度调整到待测样品浓度附近 ， 这样结果也是非常准确的 。例如 ， 样品的浓度约20ppb ， 但在0~50ppb范围建立标准曲线 ， 但线性非常不理想 ， 这时可以将标准范围调整到15~25ppb之间 ， 作五个标准 。
5、标准曲线的检验？
（1）线性检验：
即检验校准曲线的精密度 。对于以4～6个浓度单位所获得的测量信号值绘制的校准曲线 ， 分光光度法一般要求其相关系数|r|≥0.9990 ， 否则应找出原因并加以纠正 ， 重新绘制合格的校准曲线 。
（2）截距检验：
即检验校准曲线的准确度 ， 在线性检验合格的基础上 ， 对其进行线性回归 ， 得出回归方程y=a+bx ， 然后将所得截距a与0作t检验 ， 当取95%置信水平 ， 经检验无显著性差异时 ， a可做0处理 ， 方程简化为y=bx ， 移项得x=y/b 。在线性范围内 ， 可代替查阅校准曲线 ， 直接将样品测量信号值经空白校正后 ， 计算出试样浓度 。
当a与0有显著性差异时 ， 表示校准曲线的回归方程计算结果准确度不高 ， 应找出原因予以校正后 ， 重新绘制校准曲线并经线性检验合格 。在计算回归方程 ， 经截距检验合格后投入使用 。
回归方程如不经上述检验和处理 ， 就直接投入使用 ， 必将给测定结果引入差值相当于解决a的系统误差 。
（3）斜率检验：
即检验分析方法的灵敏度 ， 方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的 。在完全相同的分析条件下 ， 仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围 ， 此范围因分析方法的精度不同而异 。例如 ， 一般而言 ， 分子吸收分光光度法要求其相对差值小于5% ， 而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于10%等等 。
6、标准曲线有效期的规定？
（1）标准曲线属于实验室质量控制的范围 ， 按照《实验室资质认定评审准则》中结果控制的要求：定期使用有证标准物质（参考物质）进行监控和/或使用次级标准物质（参考物质）开展内部质量控制 。
（2）准则中并未对“定期”进行规定 ， 所以如果“定期” ， 就根据实验室的实际情况来定了 。
（3）既然准则上没说明 ， 那根据一般的分析教材 ， 当实验条件（包括药剂、人员、仪器等）发生变化时 ， 最好重新制作标准曲线 。一般来说仪器如果长期使用 ， 并经过检定 ， 是处于稳定状态 ， 而人员药剂的变化往往会较大 。如果说每次换个人操作都要换曲线 ， 那工作量就太大了 。
7、每次开机都必须做标准曲线？
从药品检测的要求来说 ， 因为：
1、每天所配的流动相都会有所不同 ， 导致出峰的时间都会有一定的差异 ， 峰面积相应都有所差异 。
2、检测器光能也在不断的衰弱 ， 因此其每天的相应值也有所不同 ， 其峰面积也有差异 。
基于以上原因 ， 原则上应该是每天都要进行标准曲线校正的 。
标准曲线不要每次都做 ， 但是每次必须进标准品样品；因为每次你的流动相和原来的不可能完全一样 ， 同时仪器的状态也在变化 ， 所以不同批次间的保留时间是不一致的 ， 所以你必须用随行标准品来定位与定量 。
8、校准曲线能不能长期使用？
每批样品应测定一个校准曲线中间点浓度的标准液 ， 其测定浓度与校准曲线标准点的浓度相对误差不得超过规定范围 ， 如果超过规定相对误差 ， 需重新绘制校准曲线 。
也可以这样说 ， 不同的分析项目 ， 不同的分析方法 ， 校准曲线斜率的稳定性不同 。如校准曲线的斜率较为稳定 ， 则在样品分析时 ， 可只测定两个标准点 ， 当此两个标准点与原曲线相应点的相对偏差均小于5%时 ， 可使用原校准曲线 。因此 ， 样品分析前 ， 需根据斜率的稳定性来确定是否需同时制作校准曲线 。
我们一般的做法是 ， 根据检测的频率来做 ， 如果该项目天天都要检测 ， 并且检测量较多时 ， 要求至少每周做一次曲线 。如果检测量上 ， 一个月都没有几单的话 ， 就一个月做一次曲线 。当然 ， 仪器如果出现故障并大修后回来的 ， 经过检定后 ， 需要重新做曲线 。
9、标准曲线是否必须过原点？
标准曲线不一定非要过原点 ， 只要线性好就可以了 。因为做空白的话基本上不会过原点 。过原点是强制过的 ， 实际曲线可能不过 ， 就会造成误差 。不过原点是因为有系统误差 。
针对是否过原点(0 ， 0)问题 ， 可以从原点(0 ， 0)代表的意义来考虑：
即所测组分浓度为零的时候 ， 信号响应值（液相色谱也就是峰高或者峰面积）是否也为零 。通常来说色谱分析是属于这种情况的 ， 因而可以把（0 ， 0）点作为一个浓度水平计入标准曲线（甚至不需要真的去配一个浓度为零的标准溶液来进样） ， 这也是单点法定量的一个依据；而类似的情况在光谱法测定时就讲不通了 ， 浓度为零的标准溶液（本底）响应信号（吸光度）往往不是零 ， 这个时候标准曲线就不一定过原点了 。
10、标准曲线的线性范围？
线性范围这个大家都比较清楚 ， 主要从相关系数r看 ， 一般要求r大于等于三个九 。之前做实验有时候浓度高时 ， 线性不好 ， 高浓度点不在标准曲线上 ， 而是在标准曲线的下面 ， 而且离拟合的标准曲线比较远 。遇到这种情况 ， 标准曲线的线性相关系数就很差 ， 有时候才一个九 ， 最后我终于想明白了 ， 如果自己用手动拟合的话 ， 用平滑的曲线去连接所有点的话 ， 你就会发现 ， 如果在线性范围内 ， 连接起来就是直线 ， 如果超出了线性范围 ， 连接起来就是一条弯曲的曲线 。
11、相关系数的有效数字？
GB5750.3-2006 8.2.7项有如下规定：校准曲线相关系数只舍不入 ， 保留到小数点后出现非9的一位 ， 如0.99989→0.9998 。如果小数点后都是9时 ， 最多保留小数点后4位 。
12、Y=bX和二次曲线的选用？
标准曲线我们通常采用的是Y=a+bX ， 曲线拟合完必须要做统计检验 ， 且要做统计完备的线性检验和失拟检验 ， 然后再做a与0的差别检验 ， 如果a与0的统计学上无差异 ， 你就可以考虑用Y=bX的拟合曲线 ， 拟合出来后同样做线性检验和失拟检验 ， 如果线性检验合格（P0.05）此时你就可以采用Y=bX 。
二次曲线的采用同样是这样的道理 ， 如果你Y=a+bX时拟合不合格 ， 你就考虑用Y=a+bX+cX2 ， 同样做失拟检验 ， 考察拟合的符合情况 。如果Y=a+bX和Y=a+bX+cX2都满足拟合检验和失拟检验合格 ， 则采用Y=a+bX形式 ， 这样符合统计学上参数最少的统计简洁性原则 。
标准曲线法有一定的优势 ， 也有一定的缺陷 ， 它特别适合于大量样品的分析 。但由于每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能 ， 柱温 ， 流动相流速及组成 ， 进样量 ， 柱效等）很难完全相同 ， 因此容易出现较大误差 。此外 ， 标准工作曲线绘制时 ， 一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品） ， 而实际样品的组成却千差万别 ， 因此必将给测量带来一定的误差 。
了解各个分析项目校准曲线斜率的稳定性及影响稳定性的主要因素 ， 可决定是否能采用带标点检验原校准曲线 ， 省略重新制作校准曲线;从校准曲线斜率的变化 ， 可判断标准溶液的稳定性 ， 从而确定其标定周期;分析低浓度样品时 ， 应使用高纯度的水和试剂 ， 以减少空白值 ， 降低样品的分析误差 。
科学地运用校准曲线 ， 对于降低分析成本、提高检测质量有着重要的意义 。

做标准曲线的12个经典问题 校准曲线

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