T-DNA上共含有tms、tmr和tmt 3 套基因 。其中tms和tmr 2 套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤 。tms基因组由iaaH和iaaM 2 个基因组成，控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径；tmr 基因组中的iptZ 负责由异戊烯焦磷酸和AMP 合成分裂素的反应；tmt 基因组的编码产物可催化合成冠瘿碱(Opines) 。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用 。
此外，在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界(left border, LB)和左边界(right border, RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义 。
（2）Ti 质粒的转化机理
根癌农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位会分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质能诱导Ti 质粒上的vir基因以及根癌农杆菌染色体上的一个操纵子表达 。vir 基因产物将Ti 质粒上的T-DNA 单链切下，而根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA 结合形成复合物，转化植物根部细胞 。整个过程大致可分为以下几个步骤：①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着；②根癌农杆菌对植物信号物质的感受；③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色体上操纵子的活化；④T-DNA 复合体的产生；⑤T-DNA复合体的转运；⑥T-DNA整合到植物基因组中 。
（3）野生型Ti 质粒的改造和中间载体的构建
Ti 质粒是植物基因工程的一种天然载体 。但野生型Ti 质粒不能直接用作克隆外源基因的载体 。这主要表现在：①野生型Ti 质粒分子过大，因而在基因工程中操作起来十分麻烦；②野生型Ti 质粒上分布着各种限制型核酸内切酶的多个酶切位点，不论用何种限制型核酸内切酶切割，都会切成很大片段 。而且即使在T-DNA 上也很难找到可利用的单一的酶切位点；③T-DNA上的tms和tmr 基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍转基因植物细胞的分化和植株的再生；④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨
酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；⑤野生型Ti 质粒没有大肠杆菌(Escherichia coli)的复制起点和作为转化载体的选择标记基因 。因此，必须对野生型的Ti 质粒进行改造后才能作为转基因植物的载体 。
对野生型Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面：①删除T-DNA上的tms、tmr和tmt
基因；②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；③引入植物细胞的筛选标记基因，如细菌来源的新霉素磷酸转移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPT II)等，便于转基因植物细胞的筛选；④引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；⑤插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆 。⑥除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度 。由于大肠杆菌具有能与根癌农杆菌高效接合转移的特征 。因此，为了使Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将T-DNA片段克隆进大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌农杆菌的Ti 质粒 。带有重组T-DNA的大肠杆菌衍生载体称为中间载体(intermediate vector)，而接受中间载体的Ti 质粒则称为受体Ti 质粒(acceptor Ti pla *** id) 。构建中间载体是解决Ti 质粒不能直接导入目的基因的有效 *** 之一 。
中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体(如pBR322 质粒)中插入了一段合适的T-DNA片段而构成的小型质粒 。
（4）中间载体的表达构建
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