自己学东西,觉得举步维艰。网上的资源太多了,反而让人很容易陷入一种焦躁和慌乱中。不知道从哪里理出头绪来。是碎片化的,不成体系的。自己需要对信息进行过滤,整合成自己的方法。目标:加载作者的处理过的有细胞类型标签的数据,对数据进行差异表达分析,找到特定的组织中差异表达的基因。
注明以下使用到的数据来源:http://development.psychencode.org/files/processed_data/scRNA-seq/Sestan.fetalHuman.Psychencode.Rdata
该数据为这篇文章中作者用到的,胎儿的大脑数据。
在Rdata中存放有三个数据矩阵。
我们需要在上述已有数据的基础上,实现我们的目标。
- count2:原始count值
- cpm2:归一化处理后的数据矩阵
- meta2:关于细胞与样本的详细注释信息,里面有作者已经分类后的每一个细胞对应的数据类型
整体上这个数据有60155行,762列。
load("F:/Rworkplace/celltype_specifc/Sestan.fetalHuman.Psychencode.Rdata")
library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)
dim(count2)
[1] 60155 762
data<-CreateSeuratObject(counts=count2,
project = "fetal",
meta.data = https://www.it610.com/article/meta2,
min.cells=0,
min.features=0)
#data@meta.data<-meta2
data<-NormalizeData(data,normalization.method="RC",scale.factor = 1000000) #这里就是计算了cpm的值
#这里实际上进行了cpm的转换#筛选标准:该基因至少在300个细胞中表达,每一个细胞中至少有300个基因表达,对这个matrix进行行列层面的筛选。
将原先meta.data中的celltype的变量赋值到Idents中。得到细胞的类型标签。
Idents(object=data)<-data@meta.data$ctype #这一步是成功的第一步,已有的细胞注释的结果
levels(x=data)
到这一步的话,似乎就是利用原始的数据来做的。
我之所以举步维艰,是因为:接着进行差异表达基因分析。
(1)我不知道每一步的含义,是否可以视特殊情况而去除;
(2)我不知道更多的函数应该怎样使用;
markers<-FindAllMarkers(data,only.pos = TRUE ,logfc.threshold = 2,min.pct = 0.25,test.use="roc")
write.csv(markers,"DEG_all2.csv")
VlnPlot(object=data,feature=c("ENSG00000189238-LINC00943"),log = T)
到这里虽然还不知道如何使用cpm后的数据进行差异表达分析。
但是比较欣慰的是,可以确保找到的差异表达基因与作者的基因是一样的了。即,得到的DEG_all.csv这个list是有意义的。
使用roc进行差异表达分析,似乎效果更好。【首选:有时间要总结一下差异表达分析常用的方法】
得到这个list之后,我们与我们自己的list进行比照,看看我们的list中,有多少是在这个细胞类型特异性的差异表达基因中的。
DEG<-read.csv("DEG_all2.csv")
library(stringr)
gene_split<-as.data.frame(str_split_fixed(DEG$gene,"-",n=2))
head(gene_split)
head(DEG)
DEG_m<-cbind(DEG,gene_split)
interest<-read.table("result_coding_gene_id_2.txt")
DEG_interest<-merge(DEG_m,interest) #112/4205
write.csv(DEG_interest$gene,"DEG_interest_celltype.csv")
得到了一些基因在特定的细胞类型中表达。
table(DEG_interest_2$cluster) 112/4205
Astro Endo ExN1 ExN2 ExN3 InN1 IPC1根据这些基因,绘制heatmap。
6 26 2 7 9 2 4
IPC2 Microglia NasN1 NasN5 NasN6 NEPRGC1 NEPRGC2
1 20 2 1 1 1 2
NEPRGC3 Oligo OPC1 Pericyte
2 4 2 20
DEG_interest_2<-DEG_interest[order(DEG_interest$cluster,decreasing =FALSE ),]
DoHeatmap(data,features = DEG_interest_2$gene,draw.lines = TRUE,label = T,size = 2)+NoLegend()
可能这个工具还没有用熟悉,所以画出来的图是真的很丑(后面再进行润色和调整)。
文章图片
保存这次的处理结果。
DEG_interest_2<-DEG_interest[order(DEG_interest$cluster,decreasing =FALSE ),]
a<-subset(DEG_interest_2,select=c("gene","cluster"))
tissue<-rep("fetal",dim(DEG_interest_2)[1])
d<-cbind(a,tissue)
colnames(d)<-c("gene","cell_type","label")
write.csv(d,"DEG_interest_celltype2.csv")
最后测试一下分类标签是否正确。
VlnPlot(object=data,feature=c("ENSG00000122547-EEPD1"),log = T)
文章图片
完成目标。
现在存在的疑惑就是,是否需要吧ExN1、ExN2、ExN3这些都属于ExN细胞的细胞类型合并起来进行差异表达分析。接下来想处理adult的数据,没想到遇到了不能避免的数据太大的问题。
现在先这样,可能后期,还有再加上这些大的class(如,ExN/NasN/IPC)所共有的相对于其他class而言的差异基因。
load("F://Rworkplace//celltype_specifc//phyEncode_adult//Sestan.adultHumanNuclei.Psychencode.Rdata")
library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)
报错:
Error: cannot allocate vector of size 3.0 Gb【笔记|R语言画图 | 如何看已知基因list的细胞类型特异性表达()】只能回到服务器上操作。但是服务器上,我连seurat的包都安装不了,哭泣!看来,那边是必然要解决的问题,有必要可以求助师兄!
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