基因家族分析2|基因家族分析2 || 数据库检索与成员鉴定数据库检索与成员鉴定|

基因家族流程：基因家族分析（一） ==================================================================
数据库检索与成员鉴定
1)数据库检索：常用数据库（植物） · TAIR: http://www.arabidopsis.org/
· phytozome ：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html
· Ensemblplants:http://plants.ensembl.org/index.html
· Pfam:http://pfam.xfam.org/ （蛋白结构域注释的分类系统）
2)已鉴定的家族成员获取（多物种进化树需要）

1.具体家族信息可以参考拟南芥已经发表的基因家族：https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp
2.按照文献中的ID从上述phytozome 等数据库中下载，下载该物种蛋白序列文件，找到对应成员。

注意：文献中的数量可能比实际少，因为数据库的更新。
3)非鉴定的家族成员获取（即基因家族分析）

文件准备：hmm，蛋白库，拟南芥目标蛋白家族序列。
比对工具：一般使用blast和hmmer。

[1] hmm文件准备：为了大家可以实操，选择拟南芥一个常见家族：14-3-3也叫GRF，如下图，下载蛋白序列为At_14_3_3.fa 。

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At 14-3-3.png

1.将拟南芥14-3-3的第一个At4g09000蛋白或者已有物种的家族蛋白序列上传到phmmer search ，查看该14-3-3蛋白所含domain的hmm（如(PF00244）模型，并链接到pfam下载hmm模型。

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14-3-3 domain.png

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model.png

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下载hmm.png

2.文献中14-3-3在pfam accession为PF00244，在pfam检索，其余方法同上。

[2] 软件hmmer和blast鉴定成员。 1. hmmer下载及安装 windows版本3.0官网不再提供，以下分析都是linux环境

#以下为目前最新版本3.2.1 (13 June 2018) $ wget http://eddylab.org/software/hmmer/hmmer-3.2.1.tar.gz $ tar zxf hmmer-3.2.1.tar.gz -C ~/biosoft/ $ cd ~/biosoft/hmmer-3.2.1 $ ./configure $ make $ make check $ echo 'PATH=$PATH:~/biosoft/hmmer-3.2.1/src/' >> ~/.bashrc $ source ~/.bashrc $ hmmsearch -h Usage: hmmsearch [options] Options directing output: -o : direct output to file , not stdout -A : save multiple alignment of all hits to file --tblout : save parseable table of per-sequence hits to file --domtblout : save parseable table of per-domain hits to file --pfamtblout : save table of hits and domains to file, in Pfam format --acc: prefer accessions over names in output --noali: don't output alignments, so output is smaller --notextw: unlimit ASCII text output line width --textw : set max width of ASCII text output lines[120](n>=120)

hmmer鉴定：用的南瓜蛋白数据库

pengzw@super-server:~$ wget http://pfam.xfam.org/family/PF00244/hmm pengzw@super-server:~$ mv hmm 14-3-3.hmm pengzw@super-server:~$ wget ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/Cucurbita_moschata/v1/Cmoschata_v1.protein.fa.gz pengzw@super-server:~$gunzip Cmoschata_v1.protein.fa.gz pengzw@super-server:~$ hmmsearch -o ./14-3-3_hmm.txt 14-3-3.hmm Cmoschata_v1.protein.fa pengzw@super-server:~$ ls 14-3-3.hmm14-3-3_hmm.txtCmoschata_v1.protein.fa

注意：
1.某些数据库蛋白存在可变剪切，分析要求一个基因仅保留一个represent 序列，一般都是保留最长的序列。这里拟南芥数据库有仅保留一个序列的文件，直接下载即可。
2.保留最长转录本方法：（1）CJ大神TBtools软件的Fasta Longet Representative功能。（2）python脚本：参考生信媛。

【基因家族分析2|基因家族分析2 || 数据库检索与成员鉴定】结果如下，位于横线以上有19个成员，横线下方基本排除可能，但是我一般为了保险都要确定一下。

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hmm result.png

2.blast鉴定:用拟南芥基因家族蛋白BLAST所用物种基因组，取相似性大于50%（可根据需要求修改或者文献）的序列。At_14_3_3.fa从拟南芥数据库下载整理。

pengzw@super-server:~$ makeblastdb -in Cmoschata_v1.protein.fa -dbtype prot -parse_seqids -out Cmoschata_v1.protein.db #blast比对： pengzw@super-server:~$ blastp -query At_14_3_3.fa -db Cmoschata_v1.protein.db -out 14-3-3.blast -evalue 1e-10 -num_threads 4 -outfmt 6 -num_alignments 5 pengzw@super-server:~$ cat 14-3-3.blast|awk '$3>=50 {print $0}' >>50.txt

结果：去除重复值，有14个结果。

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blast 50%.png
3.domain确定：pfam，phmmer search ，SMART，NCBI Batch CD- search（我喜欢phmmer）。推荐：序列太多，下载本地版pfam，详情见我的另外一篇，lnRNA | pfam预测 https://www.jianshu.com/p/3a19db8f3cbb

将hmmer的结果的id整理出来，提取蛋白序列（TBtools，再一次感谢CJ大神），再提交到phmmer网站，查看是否只有一个14-3-3 domain。

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phmmer.png

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phmmer result.png

4.汇总结果结合1.2.3步，命令行或者excel核对求交集，得到最终结果南瓜中有12个14-3-3家族成员。
5.总结及注意事项： ? 只有一个domain，hmmer很快，但是可能结果很多，例如MAPK、MAPKK、MAPKKK等，它们的domain都为pkinase，分族是根据进化树分支结果，这时需要结合blast结果验证。
? 两个及以上domain，需要利用检索取两个较少结果的交集，可结合blast结果验证。