iPSC基因编辑细胞-为各类疾病研究打开新大门

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对于许多严重的疾病,例如心力衰竭、晚期糖尿病、血友病、骨髓瘤、末期肝硬化等,目前还未能研发出完全治愈这些疾病的药物,最有效的方法是异体移植。但是由于供体有限以及自体免疫排斥反应的风险,科学家们苦心专研,尝试寻找除异体移植外,更高效、安全的治疗方法。诱导型多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)可以来源于受体本身的体细胞,排除了免疫排斥反应的风险,且具有不断自我更新和多向分化潜能,iPS细胞来源的心肌细胞、肝细胞、神经细胞、T细胞、造血干细胞和胰岛细胞的移植治疗能够有效解决许多医学难题。通过CRISPR/Cas9的方法,将模拟疾病发生的突变引入iPSC,或修复iPSC疾病模型中的突变, 再分化得到所需要的细胞进行研究或治疗,是目前iPSC研究的大热门。
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iPSC的CRISPR基因编辑,为各类疾病研究打开新大门 由于iPSC不像普通肿瘤细胞系那样具有总染色体异常和异常强烈的DNA损伤反应的特点,基因编辑在人类iPSC中成功率更低。但是由于CRISPR/Cas9具有效率高、易于构建和在人细胞中的毒性较低等优点,在iPSC基因编辑中备受青睐。
CRISPR/Cas9敲除iPSC中RAG2基因,有效生成具有稳定抗原特异性的CD8αβ-T细胞
T细胞的数量和增殖困难是T细胞免疫治疗的主要障碍,通过使用具有“再生”能力的多能干细胞诱导分化成为具有抗原特异性的T细胞(T-iPSCs)可以克服这一障碍。严格的抗原特异性对于安全有效的T细胞免疫治疗是必不可少的,然而,人T-iPSC分化的CD8αβ细胞在CD4/CD8双阳性分化过程中,通过T细胞受体(TCR)α链的重排会失去抗原特异性。通过使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重组酶基因(RAG2)阻止了这种额外的TCR重排。含有稳定的TCR的CD8αβ-T细胞在异种移植肿瘤模型能有效地抑制肿瘤生长。这些方法有助于安全有效的T细胞免疫治疗。
CRISPR-U?可以通过核转染法高效地将gRNA和Cas9转入iPSC细胞中,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证,筛选出基因敲除的阳性克隆。(Minagawa, Atsutaka, et al.)
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病人细胞构建iPSC疾病模型,使用CRISPR/Cas9修复引起疾病的点突变位点,深入研究点突变的病理性作用 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种进行性和不可逆转的神经退行性疾病,可导致神经细胞变性和脑萎缩,被认为是最常见的痴呆形式。PSEN1基因A79V突变可引起阿尔茨海默症,通过研究此突变对细胞表型的影响,可帮助研究者深入研究此疾病的病理,从而开发出更有效的治疗方法。研究者将阿尔茨海默症患者的体细胞诱导为多能干细胞(iPSC),然后通过用野生型序列替换点突变序列,修正突变的基因。通过研究患者的iPSC和修正后的iPSC,可以得知该突变对细胞表型的影响,从而深入研究该突变的病理性作用。
CRISPR-U?可以通过使用核转染法高效地将gRNA载体(含Cas9)和Donor共转入细胞中,gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后,iPSC细胞以外源携带野生型序列的Donor作为模板进行同源重组修复(HDR),将目标序列重组到基因组点突变的靶位点上。(Pires, C., et al.)
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iPSC的AAVS1安全位点敲入凝血因子9,所分化获得的肝细胞可用于治疗乙型血友病 目前治疗血友病最普遍的方法是替代疗法,但这种方法有病毒感染的风险,且是一种需要终生持续治疗的方法。只有基因治疗才能从根本上治愈血友病,CRISPR/Cas9系统可用于血友病的基因治疗。细胞中凝血因子8和9(F8和F9)突变是引起血友病的主要原因。之前就有研究表明F9是更有效的基因治疗目标。通过构建以AAVS1位点为靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA质粒和AAVS1-EF1α-F9 cDNA嘌呤霉素donor 载体,并将其导入iPSC中。将F9 cDNA插入AAVS1位点的iPSCs分化为肝细胞,在培养上清中成功检测到人因子IX(hFIX)抗原和活性。最后,通过脾脏注射将肝细胞移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠体内,从而起到治疗乙型血友病的作用。
CRISPR-U?可以通过使用通过核转染法高效地将gRNA、Cas9和Donor共转入iPSC细胞中,进行药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序,筛选出敲入纯合的阳性克隆。(Lyu, Cuicui, et al.)
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iPSC诱导分化,使“自体移植”不再遥不可及 【iPSC基因编辑细胞-为各类疾病研究打开新大门】人胚胎干细胞来源于早期胚胎而使其研究备受伦理争议,而且人胚胎干细胞来源的分化细胞进行异体移植时存在排斥反应,在一定程度上限制了其临床应用。iPSC可以诱导分化为不同种类的细胞用于科学研究。经过日积月累的研究开发,目前已经可以从患者组织(如成纤维细胞)或现有的iPSC中产生具有功能的、成熟的肝细胞、神经细胞、T细胞、心肌细胞、造血干细胞和胰岛细胞等。
iPSC诱导分化流程: iPSC基因编辑细胞-为各类疾病研究打开新大门
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源井生物的iPSC平台
源井生物专注于iPSC重编程、基因编辑、诱导分化的优化,已建立一套成熟的实验流程。结合源井生物独立创新的CRIPSR-U?技术,打靶效率比传统方法提高十倍,真正做到“实验快人一步“!利用CRISPR-U? 的技术优势,源井生物已成功在超过100种细胞系上实现基因编辑。
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