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引物二聚体（pcr引物二聚体特别亮）

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引物二聚体(pcr引物二聚体特别亮)
基本原理
聚合酶链反应是一种体外特异性核酸序列扩增技术。模拟DNA的自然复制过程包括三个基本反应步骤:变性-复性-延伸。根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成了两条不同的寡核苷酸引物，与两条DNA链互补。将适量的寡核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)混合。DNA聚合酶和含有靶序列片段的模板DNA分子。经过高温变性(解开DNA双链)、低温复性(将引物附着在模板上)和中温延伸(合成新的DNA片段)三个阶段的一个循环后，DNA的量可以增加一倍，然后经过30个循环后，DNA的量可以增加230倍。
典型的聚合酶链反应体系和三阶段聚合酶链反应
典型的聚合酶链反应系统组成:
脱氧核糖核酸模板
反应缓冲液
两条合成DNA引物:dNTP和MgCl2(分别为上游引物和下游引物)
耐热Taq DNA聚合酶等。
聚合酶链反应的三个阶段如下:
模板DNA的变性:将模板DNA加热到94℃左右一定时间后，将模板DNA双链或PCR扩增形成的双链DNA解离，使其与引物结合，为下一轮反应做准备；
模板DNA和引物的复性:当温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链互补序列配对；
引物延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种dNTP为反应原料，以靶DNA序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，通过DNA模板-引物偶联，合成了一条与模板DNA链互补的新型半保守复制链。反复变性-复性-延伸可以获得更多的半保守复制链，而这条新链可以成为下一个循环的模板。
实验用品
1.材料
枯草芽孢杆菌AS 1.398基因组DNA溶液
2.试剂
2×Taq酶PCR反应混合物(含Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、氯化镁和4种dNTP)；
上游引物，下游引物
石蜡油；
琼脂糖；
10×TBE电泳缓冲液:称取Tris108g、硼酸55g、Na2EDTA7.44g、双蒸水至1000mL
6×加载缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液；
EB溶液母液:将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹；
脱氧核糖核酸纯化试剂盒
DL2000TM基因标记
3.工具
超净工作台
加压釜
【pcr引物二聚体特别亮引物二聚体】高速离心机
移液管
聚合酶链反应放大器
水平电泳槽
电泳仪电源
凝胶成像系统
电饭锅/电炉
实验步骤
底漆设计
在NCBI寻找枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的基因序列，并使用枯草芽孢杆菌亚种的碱性磷酸酶基因序列。以枯草芽孢杆菌str.168为模板设计引物。根据表达质粒载体pET-28a-c (+)的DNA序列和图谱，用Primer Premier 5.0软件设计了两对引物。上游引物和下游引物分别具有BamH和Hind的限制性酶位点，这两个不同的限制性酶识别位点分别在引物中加下划线。引物序列如下:
上游引物:
5 '-cgggatccattaaaaaaaagatttgt-3 '(BamHⅰ)
下游引物:
5 '-ccgaagcttttattttccagtttt-3 '(Hindⅲ)
基因增殖
以提取的基因组DNA为反应模板，用合成的引物通过聚合酶链反应扩增编码ALF的DNA序列。

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加入上述试剂后，离心5 s并混合均匀，加入20 μL石蜡油覆盖混合物，防止PCR过程中样品中水分蒸发。

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当所有反应完成后，将PCR仪的温度设置为保持在4℃ 。反应后，每个样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测5μL，基因长度约为1400bp 。添加样本DL2000TM标记作为电泳标记。电泳后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照。
产品净化
用DNA纯化试剂盒进行纯化，具体步骤如下:
(1)聚合酶链反应后，将反应液从聚合酶链反应管转移到干净的1.5毫升埃彭道夫离心管中，加入4倍体积的结合缓冲液混合均匀。将纯化柱放入收集管中，将混合溶液转移到柱中，并在室温下放置2分钟。
(2)以12000转/分钟的速度离心1分钟。
(3)倒出收集管中的废液，将净化柱放入同一收集管中，加入600 μ l洗涤液，以12000 r/min离心1 min 。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)倒出收集管中的废液，将净化柱放入同一收集管中，以12000 r/min离心2分钟。
(6)将3S柱放入另一个1.5 mL离心管中，在纯化柱膜中心加入30 μ L TE，37℃静置2 min 。
(7)以7)12000 r/min离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或在-20℃保存备用。
需要注意的事项
1.1的灵敏度。PCR反应非常高。为了防止污染，所用的0.2毫升埃彭道夫管和吸头必须是新的、无污染的、无酶的。实验操作应尽可能在无菌手术台上进行。
3.使用工具酶和DNA样本的操作必须在冰浴条件下进行，使用后的剩余应立即放回冰箱。
3.应该有一个阴性对照，包含除模板DNA以外的所有其他成分。
4.所用引物的浓度一般为0.1 ~ 1.0 μ mol/L，浓度过高容易形成引物二聚体或增加非特异性产物。过低会影响效率。
5.聚合酶链反应产物应通过电泳鉴定，在纯化和回收聚合酶链反应产物之前，可以获得相同分子大小的目标条带。
结果分析
拍摄聚合酶链反应产物的凝胶电泳结果并进行分析。