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什么是溶血性链球菌! 溶血性链球菌!( 二 )

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3危害
链球菌有很多种，而猪链球菌与人类关系密切 。在猪链球菌的多种血清型中，猪链球菌2型是猪最重要的病原 ， 致病性最强 。链球菌的致病性与溶菌酶释放蛋白、细胞外蛋白因子、溶血素等毒力因子有关 。
在中国 ， 2005年四川部分地区暴发的猪链球菌2型导致200多人感染 ， 38人死亡 。在荷兰 ， 屠宰场工人和农场饲养员的猪链球菌脑膜炎年发病率约为3/10万 ， 是不在屠宰场工作的人的1500倍 ， 屠夫的猪链球菌脑膜炎发病率为1.2/10万 。在德国，屠夫、屠宰场工人和肉类加工厂工人是猪链球菌在鼻咽部定居的高危人群 。在新西兰，1980年后的研究表明 ， 9%的奶农、10%的肉检人员和21%的养猪户对猪链球菌血清型2呈阳性 ， 表明部分人存在亚临床感染 。
4检测方法
包括病原分离鉴定方法、分子生物学方法、免疫学方法ELISA等 。
4.1分离和鉴定方法
4.1.1样品处理
取25g(或25mL)待测样品 ， 加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液 。
4.1.2接种培养
吸取5mL悬液接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤中，或直接在血平板上画线(若待测样品污染严重，可同时接种5mL于Peak氏肉汤中)，36℃孵育24h，36℃孵育24h，搅起带溶血圆形突起B的微小菌落 ， 在血平板上分离纯化，观察培养特性、溶血情况、液固中革兰染色及形态，进行循环磷酸 。
CAMP测试
在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养物画一条直线，再用链球菌培养物画一条直线，与金黄色葡萄球菌培养物的直线垂直 ， 但不要触碰，它们之间的距离为3 ~ 5 mm，链球菌分离物的直线之间的距离为10 ~ 20 mm，37℃孵育24小时后观察结果 。两条线交界处箭头状溶血区为阳性 。
4.1.4链激酶试验
吸收0.2毫升草酸钾血浆，加入0.8毫升灭菌生理盐水，混匀，然后加入0.5毫升36℃培养18 ~ 24小时的链球菌肉提取物肉汤和0.25毫升0.25%氯化钙，混匀，36℃水浴10分钟 ， 血浆混合物会自行凝固 。观察血块再次完全溶解的时间，完全溶解为阳性，24小时后未溶解为阴性 。同时，肉提取物肉汤用作阴性对照，已知的链激酶阳性菌株用作阳性对照 。
4.1.5杆菌肽敏感性试验
将典型菌落的菌液涂在血平板上，每张含0.04U的杆菌肽纸用无菌镊子放在平板上，36℃培养18 ~ 24h 。如果有抑菌圈，就是阳性 。使用已知的阳性菌株作为对照 。
4.2分子生物学方法
挑取单个可疑菌落，接种于Luria-贝尔塔尼(LB)肉汤培养基中，37℃摇匀过夜，将1.0mL菌悬液置于1.5mL离心管中，用冷冻离心机以12000转/分钟离心10分钟 ， 弃去上清液，加入1.0mL灭菌双蒸水，旋入菌悬液，水浴以3000转/分钟煮沸10分钟 。上游引物为5’-gtacagttgctagacgtatc-3’，下游引物为5’-ACGTTCGATTTCATCACGTT-3’ 。反应体系:10×buffer5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)1μL，氯化镁溶液(25mol/L)3μL ， dNTP(2.5mol/L)4μL，上游引物(10 μ mol/l) 1 μ l ， 下游引物(10μmol/L)1μL，反应条件:95℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸45s，30分钟聚合酶链反应产物用1.5%琼脂糖在100伏下电泳，扩增长度为197bp的扩增产物对链球菌呈阳性 。
4.3酶联免疫吸附试验
4.3.1涂层
用0.05mol/LpH9.0碳酸盐包被缓冲液，稀释抗体至蛋白质含量为1 ~ 10 μ g/ml 。将0.1毫升抗体在4℃下加入每个聚苯乙烯板的反应孔中过夜 。第二天，将孔中3分钟的溶液丢弃，并用洗涤缓冲液洗涤3次 ， 每次3分钟(以下称为洗涤) 。
4.3.2添加样品
向包被的反应孔中加入0.1毫升稀释的细菌溶液，并在37℃孵育1小时 。然后冲洗(同时制作空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔) 。
4.3.3添加酶标抗体
向每个反应孔中加入0.1毫升新稀释的酶标记抗体(滴定后稀释) 。37℃孵育0.5 ~ 1h，洗涤 。
4.3.4添加用于显色的底物溶液
向每个反应孔中加入0.1毫升临时制备的TMB底物溶液，并在37℃孵育10 ~ 30分钟 。
4.3.5反应终止
向每个反应孔中加入0.05毫升2摩尔/升硫酸 。
4.3.6结果判断
【什么是溶血性链球菌! 溶血性链球菌!】在白色背景上，肉眼可以直接观察到结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极淡 ， 根据颜色用“+”和“-”表示 。同样可测量的OD值:在ELISA检测器上 ， 在450纳米处，用空白色对照孔调零后测量每个孔的OD值，如果大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，则为阳性 。

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