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回答一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关 。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右 。在室温的条件下，孵育3小时左右 。在4℃的条件下 ， 孵育18-24小时左右 。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色 。
一、一抗孵育时间，不能超过多久
1、一抗的定义
一抗指的是能够和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白，也就是平常所说的抗体 。二抗指的是能和抗体结合的抗体 ， 主要用于检测抗体的存在，放大一抗的信号 。
2、一抗的孵育时间
（1）一抗的孵育时间与温度，抗体浓度有关 。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右 。在室温的条件下 ， 孵育3小时左右 。在4℃的条件下 ， 孵育18-24小时左右 。
（2）如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色 。
二、双抗体夹心法检测未知抗原
1、包被
【一抗孵育超过24小时 一抗孵育时间，不能超过多久】用0.05M碳酸盐包被缓冲液（ph9.6）对抗体进行稀释，直至蛋白质含量为1-10μg/ml为止 。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml ， 4℃过夜 。第二天的时候，去掉孔内溶液，然后用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟 。
2、加样
将0.1ml经过稀释的待检样品放到反应孔中，在37℃的环境条件下孵育1小时，然后进行洗涤 。
3、加酶标抗体
在各个反应孔中，加入0.1ml新鲜稀释的酶标抗体，在37℃的环境条件下，孵育0.5-1小时，然后进行洗涤 。
4、加底物液显色
在各个反应孔中，加入0.1mlTMB底物溶液（应当临时配制） ， 37℃的环境条件下10-30分钟 。
5、终止反应
在各个反应孔孔中，加入0.05ml的2M硫酸 。
6、结果测试
（1）在白色背景下 ， 用肉眼进行观察即可 。反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅 。
（2）在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色 ， 则410nm）处 ， 以空白对照孔调零后测各孔O·D值，如果大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性 。
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