结直肠癌|粪肠球菌可预测结直肠癌复发( 二 )
三、粪肠球菌检测
根据既往研究的报道，合成检测粪肠球菌所需要的引物 。新鲜粪便样本中的基因组DNA 通过QIAamp DNA Mini 试剂盒提取 。每个样本的基因组DNA用于PCR检测粪肠球菌表达量的检测 。反应体系配制如下：40 ng 的gDNA，10 μL 的1×Power SYBR Green PCR 混合液，0.4 μM的正向与反向引物置于96 孔板中 。通过7500 Real-Time PCR System 扩增检测粪肠球菌的表达 。扩增条件如下：95 ℃10 分钟；95 ℃15 秒钟，反复40 循环；60 ℃持续1 分钟 。粪肠球菌的表达量用Ct 值表示 。
结果
一、粪便粪肠球菌与结直肠肿瘤患者的复发相关
本研究对10 对结直肠肿瘤复发患者和非复发患者粪便样本进行16s 测序分析 。根据测序数据结果进行主成分分析（principle component analysis，PCA），发现16s 数据可以对复发患者和非复发患者进行区分（图1） 。对16s 测序数据，进行线性判别分析（linear discrimination analysis，LDA），同时筛选得到在复发患者中丰度增高的菌群，如粪肠球菌、具核梭杆菌、脆弱拟杆菌；也筛选得到了在复发患者中丰度降低的菌群，如韦荣氏球菌、窄食单胞菌等；本研究发现粪肠球菌在复发患者粪便中丰度最高，作为后续研究的潜在靶点（图2） 。根据我们收集的另外83 例样本进行PCR检测，本研究发现在复发的患者粪便中，粪肠球菌的丰度更高（图3） 。
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三、粪肠球菌与患者的生存密切相关
本研究对103 例样本进行生存分析统计，发现粪便中粪肠球菌丰度更高的患者无复发生存时间更短（χ2=5.82，P=0.02）（图4），总生存时间更短（χ2=6.44，P=0.01）（图5） 。
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图4 无复发生存时间
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图5 总生存时间
讨论
卡培他滨联合奥沙利铂在结直肠癌术后的辅助治疗中取得了一定的疗效[3] 。这种联合治疗方案对大部分患者在起始阶段具有一定的疗效，而一部分患者最终会出现复发[19-20] 。复发患者对于后续的化疗和免疫治疗均不敏感[21] 。因此，探索复发相关的分子标志物，筛选药物治疗敏感的患者，具有潜在的临床意义 。
已有研究发现，肿瘤基因组改变和表观遗传改变是肿瘤复发的分子机制[22-24] 。最近基于小鼠模型的研究，显示肠道微生物能够调节肠道局部免疫反应，进而影响肿瘤对药物的敏感性[25-26]和免疫治疗的疗效[9-10] 。另外基于人群的研究也显示肠道微生物可以通过影响适应性免疫，调节肿瘤对于化疗的敏感性[27] 。通过16sRNA 测序技术，本研究对复发患者与非复发患者的样本进行分析，发现了粪肠球菌在复发患者的粪便样本中高度富集 。既往研究发现，菌群是促进肠癌发展的重要因素 。通过宏基因组测序研究发现，具核梭杆菌可以通过结合宿主细胞表面的E-cadherin 蛋白，促进肿瘤细胞的增殖[28] 。具核梭杆菌同样可以诱导LC3II 的表达，促进自噬流和自噬小体的形成，增加了结直肠癌的复发风险[29] 。由此可见，肠道菌群在结直肠癌复发过程中发挥重要作用 。我们的研究提示了粪肠球菌可能在结直肠癌复发中发挥作用，因此进一步探索粪肠球菌影响肿瘤复发的分子机制，有潜在的应用价值 。既往研究还发现，肠道微生物可以作为人类疾病诊断或判断疾病预后的分子标志物 。Jiang 等[30]报道了拟杆菌，变形菌，放线菌和厚壁菌与人类抑郁情绪相关 。在结直肠癌患者中，肠道具核梭杆菌高丰度患者无复发生存时间更长[29] 。另外的一项研究报道表明，粪便样本中高丰度具核梭杆菌预测了结直肠癌患者更短的总生存时间[31] 。同既往的研究类似，我们的研究也发现了结直肠肿瘤患者粪便中粪肠球菌的含量与结直肠癌患者的复发存在一定联系，粪便中粪肠球菌丰度高者预后更差 。粪肠球菌也是与结肠癌相关的细菌，有研究发现了在结直肠癌患者粪便中，粪肠球菌丰度更高[32-33] 。肠道中的粪肠球菌能够诱导上皮细胞内的超氧化物形成，进而诱导结肠上皮细胞损伤[34-37] 。我们的研究结果也说明了粪肠球菌可能是结直肠癌发展的促进因素之一 。与既往研究不同，本研究率先利用复发患者的粪便样本，发现了粪肠球菌可以预测结直肠癌患者术后的复发 。既往的研究还揭示了粪肠球菌能够破坏结肠上皮细胞的DNA，激活WNT/β-catenin 信号通路，诱导调节多种转录因子的转录活性[37] 。
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