单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍


文章目录

  • 摘要
  • 课程目录
    • 流程分析软件
    • 基础分析流程
      • 数据质控
        • 测序统计
        • 细胞过滤
        • 表达定量
      • 聚类分群
        • 数据合并
        • 批次效应
          • MNN矫正
          • CCA矫正
          • harmony矫正
        • 细胞过滤
        • 亚群聚类
          • 高变基因筛选与PCA分析
          • 聚类
        • 可视化
      • 亚群鉴定(关键,耗时最久)
        • 标记基因
        • 亚群定义
        • 特征分析
          • 频率统计
          • 亚群特征表达基因
    • 个性数据挖掘
      • 瞬时状态
      • 细胞演化
      • 细胞关联
  • 小结

摘要 本次笔记是基迪奥单细胞课程第二章,根据课件以及上课老师的情况来看,比之前的美格和菲沙都要好一些,而且价格更优惠。从官网也可以看到基迪奥在培训这方面是作为重点业务。等上完剩余课程,我会进行一个简单的小结,来评估几个公司之间的课程质量。
之前公司生信团队已经对单细胞分析有部分研究讨论,本次课程可以对大家进行一个查缺补漏,内容也更加全面和体系化,因此还是比较推荐。
课程目录 流程分析软件
软件 期刊 运行环境
CellRanger - -
Seurat Nature Biotechnology R
Scanpy Genomic Biology python
scVI Nature Methods python
Bioconductor Nature Methods R
……
基础分析流程 数据质控
测序统计 统计测序饱和度、捕获细胞数、平均数据量、平均检测基因数。
使用官方软件:Cell Ranger
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

细胞过滤 1)高RNA量细胞捕获
UMI总量最高的前N(预期细胞数)个细胞RNA总表达丰度的
99%分位数的1/10,作为有效细胞的最低阈值
2)低RNA量细胞捕获
确定空载的GEM的丰度基线,然后找出与空载的GEM存在显著差异
的GEM。这个步骤可能可以额外找到低RNA丰度的细胞。
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

表达定量 Read1 提 取 16bp GemCode Barcode 和12bp UMI,
Read2 提 取 cDNA插入片段
利用GemCode序列来区分细胞
利用UMI来区分不同原始转录本:利 用Read2 比对基因,
利用Read1 的UMI进行定量
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

聚类分群
数据合并 同时分析多个样本时,需要将各个样本合并为一套数据,便于
后期进行样本间的比较。
批次效应 批次效应(Batch effect)通常指的是实验指标检测中,来源关注的生物学处理效应之外的其他因素导致的样本结果的波动。
比如所检测的样本来源不同的实验环境、不同检测技术、试剂批次变化、不同实验员手法的差异,都会额外引入差异。
批次效应理论上在任何实验中都可能存在。高通量测序由于检测精度高,因此对批次效应更加敏感。
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

批次效应带来的基因表达变化,对任何定量研究都有影响。
? 10x单细胞研究的额外影响:导致本该聚类在一起的细胞因为批次效应被分为不同的簇,影响了细胞亚群鉴定的准确性,以及下游的所有分析。
实验解决方法:
  1. 有条件,就尽可能一次收集所有样本,一次做完(但实际情况往往不允许)
    2)采用速冻法保存样本,等收集足够以后,用提核法一次完成文库制备(样本难收集,周期长的项目,可以考虑这种方法)。
    生信解决方法:
MNN矫正 单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

CCA矫正 单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

实操矫正代码
#####代码例子: ## We then identify anchors using the FindIntegrationAnchors function, which takes a list of Seurat objects as input, and use these anchors to integrate the two datasets together with IntegrateData. #(1)# 建立MNN关系对 immune.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = ifnb.list, anchor.features = features) # (2)对表达量进行矫正 immune.combined <- IntegrateData(anchorset = immune.anchors) #(3)后续的聚类分群、差异分析等与正常流程类似

harmony矫正 首先,Harmony应用主成分分析,将转录组表达谱嵌入到低维空间中,然后应用迭代过程去除数据集特有的影响。
(A)Harmony概率性地将细胞分配给cluster,从而使每个cluster内数据
集的多样性最大化。
(B)Harmony计算每个cluster的所有数据集的全局中心,以及特定数据
集的中心。
(C)在每个cluster中,Harmony基于中心为每个数据集计算校正因子。
(D)最后,Harmony使用基于C的特定于细胞的因子校正每个细胞。由
于Harmony使用软聚类,因此可以通过多个因子的线性组合对其A中进行
的软聚类分配进行线性校正,来修正每个单细胞。
重复步骤A到D,直到收敛为止。聚类分配和数据集之间的依赖性随着每一
轮的减少而减小。
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

harmony算法优势
  1. 整合数据的同时对稀有细胞的敏感性依然很好;
  2. 省内存,运行速度快,适用于大样本;
  3. 适合于更复杂的单细胞分析实验设计,可以比较来自不同供体,组织和技术平台的细胞。
细胞过滤 细胞过滤是在开始正式分析前,进一步过滤得到可信的细胞用于
后续分析。
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

人为设定的一些经验标准,例如:
单细胞中鉴定到的gene数量
单细胞中UMI的总数。UMI总数过高则可能是由于实验过程中两个细胞进入了一个微滴,这类数据需要去除。
单细胞中UMI的线粒体基因表达量比例(小于10%,数值不固定)
亚群聚类 算法步骤:
(1)表达量均一化:A = log( 1 + ( UMIA ÷ UMITotal ) × 10000 )
其中,A:目标细胞中目标基因A的表达量;UMIA: 目标细胞中A基因的UMI数量;UMITotal:目标细胞中所有UMI数量的总和;log:以e为底数的自然对数。本质上就是消除不同细胞数据量的不同(因此,cell ranger的深度均一化是非必须的)。
(2)PCA分析,挑选主成分(降维),涉及:高可变基因筛选;
(3)聚类分群,涉及:分群标准的确定;
高变基因筛选与PCA分析 筛选方差较高的可变基因(例如top 2000)
PCA分析,并挑选显著(P<0.01)的主成分(PC),用于下一步的分析(降维)
本质:下一步用主成分进行亚群划分。因此主成分可以降低细胞间噪音信号的干扰。
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

聚类 Seurat软件使用基于图论的聚类算法对细胞进行聚类和分群。主要
包括以下步骤:
(1)构建细胞间的聚类关系:利用显著的主成分构建基于欧式距离的
KNN聚类关系图;
(2)优化细胞间聚类关系距离的权重值:利用Jaccard相似性优化细胞间
距离的权重值;
(3)聚类和分群:使用Louvain 算法进行细胞群聚类优化。
可视化 在群体单细胞领域,tSNE是更适合PCA的算法
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

  1. 在这里t-SNE(t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) 只是用于将细胞排在一个二维空间里(散点图) 。然后将每个点根据亚群来源(上一步分析得到的),涂上不同的颜色。
  2. 为什么用tSNE?
    答: tSNE是非线性的方法。简单理解就是:相似的细胞保持紧密聚类的同时,差异越大的细胞,在图中的距离越被夸大。这样不同亚群的细胞,群间的隔离更彻底,更清晰。还有类似的算法UMAP。
  3. 为什么图中相同颜色相同的细胞(属于一类)好像来源不同的簇?
    答:因为分类定义来自上一页的步骤,而这里t-SNE聚类是另一种方法。不同方法,最后呈现出的细胞的相似性并不相同。
亚群鉴定(关键,耗时最久)
10X 单细胞转录组数据解读中,最耗费精力也是最关键的一部分是亚群的定义。
可以参考的鉴定步骤:
(1)从已有研究基础,样本特性等预估样本中潜在有哪些细胞亚群;
(2)搜寻对应细胞亚群的已知基因标记;
(3)基于已知基因标记进行亚群分类识别;
(4)对于依然无法定义的细胞亚群,也可以直接从亚群上调表达的基因去推测其潜在类型。或者,可以考虑,从其他其他物种/组织文献的相关报道中推测
标记基因 标记基因:又称marker基因,就是每个亚群特征或上调表达的基因(默认是和其他所有亚群比较)
一般来源文献或数据库
数据库 物种 细胞类型 数据信息
Mouse cell Atlas 小鼠 所有 基因 细胞亚群
Cell Marker 人、小鼠 所有 基因 细胞类型 文献出处
Cancer SEA 癌细胞 基因 癌症类型 功能解析
PanglaoDB 人、小鼠 所有 基因 细胞类型 统计学分析
haemosphere 人、小鼠 体液细胞 基因 细胞类型 表达量数
亚群定义 单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

综合考虑各种逻辑,定义有争议的亚群(可以被定义到两类细胞的亚群)。
例如,本次范例红细胞相关的4个亚群,根据标记分群存在重叠。
(a) 满足IE2标记(表达的基因与不表达基因)要求的亚群只有C3,则先确定C3属于IE2;
(b) IE1只能选择C5;
? IE3(2,4)与ME(0,2,8)存在C2的重叠。无论从基因表达量还是聚类图中的距离,都很难判定,C2应该属于IE3还是ME,可能需要更多标记来判定。考虑到C2主要存在pre样本,暂时把他定义为成熟的细胞,所以分类为:
IE3:C4
ME:C0,C2,C8
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

特征分析 频率统计 细胞亚群频率(占总体百分比)的变化,也是常见的讨论内容。
这也是 10X genomics 设置生物学重复的主要意义之一。
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

亚群特征表达基因 单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

亚群特征基因的展示,经常使用小提琴图和映射图方式。
单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍
文章图片

个性数据挖掘 瞬时状态
每个细胞都有独立的分子特征,了解细胞“此时此刻”所具有的特征是异质性研究的基础。
细胞功能(GSEA、GSVA)
拷贝数变异(CNV)
细胞演化
拟时分析
RNA速率分析
细胞周期分析
细胞关联
WGCNA分析
转录因子分析
细胞通讯分析
小结 关于标记基因
(1)特异标记基因,不等于特有表达。在其他类型的组织中也存在表达,只是相对丰度更低。甚至在其他细胞类型中,也存在较高表达。
(2)某个群体里的标记基因,并不意味着这个群体每个细胞都表达,而是平均表达量和表达所占的细胞比重较高。
有可能10X的结果与之前文献的报道不完全一致(文献解析中也会再次提及)。可能原因包括:由于样本状态(药物处理)、特定的组织时期、个体差异、检测技术不同等因素。
【单细胞|2022.04.13【读书笔记】|10X单细胞转录组分析流程介绍】对单细胞有研究的小伙伴可以加微信bbplayer2021,进入交流群,一起交流研究。

    推荐阅读