单细胞转录组学习笔记-18-scRNA包学习Monocle2 单细胞转录组学习笔记-18-scR

刘小泽写于19.9.2-第三单元第七讲：使用scRNA包学习Monocle2
笔记目的：根据生信技能树的单细胞转录组课程探索smart-seq2技术相关的分析技术
课程链接在：http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=53

前言

关于monocle2

目前monocle2可以直接利用Bioconductor安装：https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/monocle.html

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")BiocManager::install("monocle") # 安装的版本是2.12.0

关于这个scRNA包

内容在：https://github.com/jmzeng1314/scRNA_smart_seq2/blob/master/scRNA/study_scRNAseq.html
要使用scRNAseq这个R包，首先要对它进行了解，包中内置了Pollen et al. 2014 的数据集（https://www.nature.com/articles/nbt.2967），到19年8月为止，已经有446引用量了。只不过原文完整的数据是 23730 个基因， 301 个样本【这里只有130个样本文库(高覆盖度、低覆盖度各65个，并且测序深度不同】，这个包中只选取了4种细胞类型：pluripotent stem cells 分化而成的 neural progenitor cells (NPC，神经前体细胞) ，还有 GW16（radial glia，放射状胶质细胞）、GW21（newborn neuron，新生儿神经元）、GW21+3(maturing neuron，成熟神经元) ，它们的关系如下图（NPC和其他三类存在较大差别）：

文章图片
数据大小是50.6 MB，要想知道数据怎么处理的，可以看：https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.datasets/human/tissues/
加载scRNA包中的数据

library(scRNAseq) data(fluidigm)> fluidigm class: SummarizedExperiment dim: 26255 130 metadata(3): sample_info clusters which_qc assays(4): tophat_counts cufflinks_fpkm rsem_counts rsem_tpm rownames(26255): A1BG A1BG-AS1 ... ZZEF1 ZZZ3 rowData names(0): colnames(130): SRR1275356 SRR1274090 ... SRR1275366 SRR1275261 colData names(28): NREADS NALIGNED ... Cluster1 Cluster2

创建CellDataSet对象
=> newCellDataSet()

# 这个对象需要三个要素 # 第一个：RSEM表达矩阵（ct = count） assay(fluidigm)<-assays(fluidigm)$rsem_counts ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts) ct[1:4,1:4] # 第二个：临床信息 sample_ann <- as.data.frame(colData(fluidigm)) # 第三个：基因注释信息（必须包含一列是gene_short_name） gene_ann <- data.frame( gene_short_name = row.names(ct), row.names = row.names(ct) ) # 然后转换为AnnotatedDataFrame对象 pd <- new("AnnotatedDataFrame", data=https://www.it610.com/article/sample_ann) fd <- new("AnnotatedDataFrame", data=gene_ann)# 最后构建CDS对象 sc_cds <- newCellDataSet( ct, phenoData = pd, featureData =fd, expressionFamily = negbinomial.size(), lowerDetectionLimit=1) sc_cds # CellDataSet (storageMode: environment) # assayData: 26255 features, 130 samples # element names: exprs # protocolData: none # phenoData # sampleNames: SRR1275356 SRR1274090 ... SRR1275261 (130 total) # varLabels: NREADS NALIGNED ... Size_Factor (29 total) # varMetadata: labelDescription # featureData # featureNames: A1BG A1BG-AS1 ... ZZZ3 (26255 total) # fvarLabels: gene_short_name # fvarMetadata: labelDescription # experimentData: use 'experimentData(object)' # Annotation:

注意到构建CDS对象过程中有一个参数是：expressionFamily ，它是选择了一个数据分布，例如FPKM/TPM 值是log-正态分布的；UMIs和原始count值用负二项分布模拟的效果更好。负二项分布有两种方法，这里选用了negbinomial.size，另外一种negbinomial稍微更准确一点，但速度大打折扣，它主要针对非常小的数据集

文章图片
质控过滤
=> detectGenes()

cds=sc_cds cds ## 原始数据有： 26255 features, 130 samples # 设置一个基因表达量的过滤阈值，结果会在cds@featureData@data中新增一列num_cells_expressed，记录这个基因在多少细胞中有表达 cds <- detectGenes(cds, min_expr = 0.1) # 结果保存在cds@featureData@data print(head(cds@featureData@data)) # gene_short_name num_cells_expressed # A1BGA1BG10 # A1BG-AS1A1BG-AS12 # A1CFA1CF1 # A2MA2M21 # A2M-AS1A2M-AS13 # A2ML1A2ML19

在monocle版本2.12.0中，取消了fData函数（此前在2.10版本中还存在），不过在monocle3中又加了回来
如果遇到不能使用fData的情况，就可以采用备选方案：cds@featureData@data
然后可以进行基因过滤 =>subset()

expressed_genes <- row.names(subset(cds@featureData@data, num_cells_expressed >= 5)) length(expressed_genes) ## [1] 13385 cds <- cds[expressed_genes,]

还可以进行细胞层面的过滤（可选）

# 依然是：如果不支持使用pData()函数，可以使用cds@phenoData@data来获得各种细胞注释信息 print(head(cds@phenoData@data)) # 比如我们看一下细胞注释的第一个NREADS信息 tmp=pData(cds) fivenum(tmp[,1]) ## [1]916162328998922098130850 14477100# 如果要过滤细胞，其实也是利用subset函数，不过这里不会对细胞过滤 valid_cells <- row.names(cds@phenoData@data) cds <- cds[,valid_cells] cds ## CellDataSet (storageMode: environment) ## assayData: 13385 features, 130 samples ##element names: exprs ## protocolData: none ## phenoData ##sampleNames: SRR1275356 SRR1274090 ... SRR1275261 (130 total) ##varLabels: NREADS NALIGNED ... num_genes_expressed (30 total) ##varMetadata: labelDescription ## featureData ##featureNames: A1BG A2M ... ZZZ3 (13385 total) ##fvarLabels: gene_short_name num_cells_expressed ##fvarMetadata: labelDescription ## experimentData: use 'experimentData(object)' ## Annotation:

聚类

在monocle3中，聚类使用的是cluster_cells() ，利用Louvain community detection的非监督聚类方法，结果保存在cds@clusters$UMAP$clusters

不使用marker基因聚类使用函数clusterCells()，根据整体的表达量对细胞进行分组。例如，细胞表达了大量的与成肌细胞相关的基因，但就是没有成肌细胞的marker--MYF5 ，我们依然可以判断这个细胞属于成肌细胞。
step1：dispersionTable() 首先就是判断使用哪些基因进行细胞分群。当然，可以使用全部基因，但这会掺杂很多表达量不高而检测不出来的基因，反而会增加噪音。挑有差异的，挑表达量不太低的

cds <- estimateSizeFactors(cds) cds <- estimateDispersions(cds) disp_table <- dispersionTable(cds) # 挑有差异的 unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1) # 挑表达量不太低的 cds <- setOrderingFilter(cds, unsup_clustering_genes$gene_id)# 准备聚类基因名单 plot_ordering_genes(cds) # 图中黑色的点就是被标记出来一会要进行聚类的基因

文章图片
step2：plot_pc_variance_explained() 然后选一下主成分

plot_pc_variance_explained(cds, return_all = F) # norm_method='log'

文章图片
step3: 根据上面的图，选择合适的主成分数量（这个很主观，可以多试几次），这里选前6个成分（大概在第一个拐点处）

# 进行降维 cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 6, reduction_method = 'tSNE', verbose = T) # 进行聚类 cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4) # Distance cutoff calculated to 0.5225779 plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition")

文章图片

> table(cds@phenoData@data$Biological_Condition)GW16GW21 GW21+3NPC 52163230

需要注意的是，使用的主成分数量会影响结果

前面使用了6个主成分，分的还不错。现在假设使用前16个主成分：

cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 16, reduction_method = 'tSNE', verbose = T) cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4) plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition")

文章图片
错误示范

以下是测试代码！

除此以外，如果有批次效应等干扰因素，也可以在降维（reduceDimension()）的过程中进行排除：

if(F){ cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 6, reduction_method = 'tSNE', residualModelFormulaStr = "~Biological_Condition + num_genes_expressed", verbose = T) cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4) plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition") } # 可以看到，去掉本来的生物学意义后，最后细胞是会被打散的。所以residualModelFormulaStr这个东西的目的就是磨平它参数包含的差异

文章图片
但是，如果是去除其他的效应：

# 如果去除生物意义以外的效应 cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 6, reduction_method = 'tSNE', residualModelFormulaStr = "~NREADS + num_genes_expressed", verbose = T) cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4) plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition")

文章图片

关于处理批次效应：例如在芯片数据中经常会利用SVA的combat函数。
磨平批次效应实际上就是去掉各个组的前几个主成分

差异分析
=> differentialGeneTest()

start=Sys.time() diff_test_res <- differentialGeneTest(cds, fullModelFormulaStr = "~Biological_Condition") end=Sys.time() end-start # 运行时间在几分钟至十几分钟不等

然后得到差异基因

sig_genes <- subset(diff_test_res, qval < 0.1) > head(sig_genes[,c("gene_short_name", "pval", "qval")] ) gene_short_namepvalqval A1BGA1BG 4.112065e-04 1.460722e-03 A2MA2M 4.251744e-08 4.266086e-07 AACSAACS 2.881832e-03 8.275761e-03 AADATAADAT 1.069794e-02 2.621123e-02 AAGABAAGAB 1.156771e-07 1.021331e-06 AAMPAAMP 7.626789e-05 3.243869e-04

作图（注意要将基因名变成character）

cg=as.character(head(sig_genes$gene_short_name)) # 普通图 plot_genes_jitter(cds[cg,], grouping = "Biological_Condition", ncol= 2) # 还能上色 plot_genes_jitter(cds[cg,], grouping = "Biological_Condition", color_by = "Biological_Condition", nrow= 3, ncol = NULL )