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斑块|一文掌握小鼠动脉粥样硬化斑块定量评估( 二 )


尽管小鼠和人类粥样斑块在结构上存在一定的相似性 ， 但与人类不同的是 ， 小鼠斑块极少发生破裂导致心肌梗死等血栓事件 ， 对斑块稳定性和动脉血栓事件的研究有赖于新的动物模型 。
小鼠模型的整条主动脉上均可形成粥样斑块 ， 包括头臂动脉、颈动脉、锁骨下动脉等 。同人类相似 ， 这些斑块主要发生于动脉小弯侧和血管分叉处 ， 可能与血流在此处形成湍流有关 。由于粥样硬化病变的严重程度与血管部位有关 ， 为了更加准确地评估病变的严重程度和干预效果 ， 增强实验结果的可靠性和稳定性 ， 使研究结果能够推广 ， 规范统一的斑块评估策略必不可少 。
对小鼠动脉粥样硬化斑块的评估通常分为两个水平：1. 大体标本油红染色 ， 即取主动脉弓或全主动脉 ， 经油红染色后评估斑块面积；2. 切片染色 ， 将主动脉根部或头臂动脉、颈动脉等冰冻切片后 ， 行油红、Masson、天狼星红或免疫荧光等染色 。冰冻切片不仅能够评估斑块的大小 ， 还能够对斑块组分进行进一步分析 。
二、小鼠处死和标本收集
1. 麻醉取血
采用异氟烷（浓度 2% ， 流量 10ml/min ， 与不同麻醉机设备有关）吸入麻醉后 ， 摘除一侧眼球采集血液 ， 20 周龄雄鼠可收集 1ml 以上血液 ， 室温静置 1~2 小时 ， 待血液充分凝固后 ， 3000 转 / 分 ， 离心 10 分钟分离血清 ， -80℃保存备用 。
2. 全身灌流
将小鼠仰卧位固定于解剖台 ， 从肋弓下缘两侧向上剪开胸腔 ， 将胸壁和胸骨、肋骨整个向上翻起 ， 充分暴露心脏 。在右心房剪开一小口 ， 将连有输液器的针头自心尖部插入左心室 ， 采用预冷的生理盐水或 PBS 进行全身灌流 。全身灌流能够减少血细胞在血管内堆积 ， 有利于下一步染色分析 。注意观察 ， 待右心房流出液体转为澄清透明 ， 肝脏由红转白 ， 提示灌流效果较好 。
3. 组织采集
斑块|一文掌握小鼠动脉粥样硬化斑块定量评估
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图4 小鼠主动脉根部冰冻切片方法示意图
将经过甲醛充分固定的心脏移入 25% 蔗糖 PBS 溶液中脱水 48 小时以上 ， 观察到心脏沉在液体底部即为脱水完成 。取出心脏 ， 滤纸吸干表面水分 ， 使用锋利的刀片沿与心脏长轴垂直方向切除心尖部 2/3（图 4A） ， 将剩余部分切面向下置于冰冻切片包埋盒中 ， 向其中加入 OCT 将组织完全浸没 ， 将包埋盒置于冰冻切片机中冷冻 。冻好的组织块可用锡箔纸包裹后 - 80℃冰箱保存 。
将冰冻切片机温度设为 - 20℃ ， 切片厚度设为 10μm 。将冻好的组织块心室面朝外固定于样本托 ， 将样本托安装在载物台上 ， 调整刀片角度以保证切片方向与主动脉根部保持垂直 。采用普通载玻片观察切片位置 。最初切片上仅可见心肌组织 ， 此时可每隔 200μm 留取一张切片显微镜下观察 。随着切片位置逐渐靠近左室流出道 ， 将观察间隔缩短为 100μm 。当镜下观察到二尖瓣时 ， 将观察间隔进一步缩短至 50μm 。
保证切片方向真正与血管走行方向垂直对斑块定量极为关键 。切面倾斜会导致对斑块大小的错误判断 。据估计 ， 仅仅 20° 的倾斜便会造成对斑块绝对面积接近 15% 的高估 。而通过对距离主动脉窦不同部位的多个切片综合评估 ， 能够降低这种切面倾斜所带来的误判 。因此 ， 为了能够更加准确的评价斑块大小 ， 我们推荐采用以下切片方案 。当镜下观察到第一个主动脉瓣出现时 ， 该位置即为切片的「零点」 。朝平行该瓣膜方向调整刀片角度 ， 以使第二个瓣膜尽快出现 。当第二瓣膜出现后 ， 依同样方式调整刀片角度 ， 以尽快出现第三瓣膜 。刀片调整前后切片位置间距离不应超过 50μm 。当三个瓣膜都出现后 ， 从距离「零点」90μm 处开始收集切片于包被多聚赖氨酸的粘附载玻片上 。每个样本留取 10 张切片 ， 切片留取方式如图 4B 所示 ， 其上所示数字为切片位置距离「零点」的距离 。

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