斑块|一文掌握小鼠动脉粥样硬化斑块定量评估( 四 )
4. 免疫荧光
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图 5-3 小鼠主动脉根部冰冻切片免疫荧光染色
采用针对特定蛋白的一抗和相应标有荧光基团的二抗对斑块中的某些成分进行免疫荧光染色 ， 以评估相应抗原在斑块中的表达情况 。其中最常用的包括抗 α-SMA ， 用以显示平滑肌细胞 ， 和抗 CD68 抗体 ， 用以显示巨噬细胞 。
染色完成后 ， 在荧光显微镜下观察拍照 ， 采用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等软件计算图像中相应颜色荧光面积 ， 除以斑块总面积 ， 即为斑块中相应抗原百分比 。例如图 5-3 中 ， 绿色荧光显示平滑肌细胞内的 α-SMA（图 5-3A） ， 红色荧光显示巨噬细胞表面抗原 CD68, 分别用绿色和红色荧光面积除以各自斑块面积 ， 即为斑块内平滑肌细胞和巨噬细胞的相对含量 。
除上述常用染色方法外 ， HE 染色、TUNEL 荧光染色、针对不同抗原的免疫组化染色等 ， 也被用来对斑块的大小和组分进行评价 。按照本文第四部分所述的切片留取方法 ， 每只小鼠留有 10 张主动脉根部不同水平的冰冻切片 ， 能够满足多种染色需求 。根据实验目的合理选择多种不同染色方案对斑块进行综合全面评估 ， 对动脉粥样硬化的病理研究具有重要意义 。
六、总结
基因工程小鼠是目前最常用的动脉粥样硬化动物模型 ， 为人类探索疾病的病理机制、寻找治疗靶点、开发新型药物做出了巨大贡献 。动脉粥样硬化的发生发展是一个慢性过程 ， 即使在小鼠体内 ， 造模也常常需要花费数月时间 。造模完成后 ， 如何准确评价病变程度又是一个挑战 。小鼠主动脉的各个部位均可形成粥样斑块 ， 不同部位斑块大小和组成存在显著差异 。为了更加准确地评估病变的严重程度和干预效果 ， 增强实验结果的可靠性和可重复性 ， 参考既往发表文献 ， 本文提供了一套规范的取材、染色和定量流程 ， 希望对于相关领域的研究者们能起到一定的帮助 。
参考文献：
1.Daugherty, A., et al., Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res, 2017. 121(6): p. e53-e79.
2.Centa, M., et al., Quantification of Atherosclerosis in Mice. J Vis Exp, 2019(148).
3.Shu, S., et al., The role of monocyte chemotactic protein-induced protein 1 (MCPIP1) in angiotensin II-induced macrophage apoptosis and vulnerable plaque formation. Biochem Biophys Res Commun, 2019. 515(2): p. 378-385.
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