细胞|踩坑多年后的吐血经验，终于能养好细胞了( 三 )
如果大部分细胞出现空泡 ， 且单个细胞内空泡数目偏多 ， 则可能细胞代次较高 ， 细胞老化所致 ， 需更换代次较早的细胞 。
#5
细胞生长逐渐变慢是什么原因？
l消化过度
l传代过密
l细胞营养不良
l细胞状态不佳或老化
l细胞存在污染
#6
细胞不贴壁 ， 有哪些原因？
1）细胞的传代最重要的是胰酶处理时间：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久 ， 容易造成细胞膜蛋白损伤 ， 使细胞贴壁不紧 ， 显微镜下观察立体感不强 ， 严重的时候甚至会造成细胞死亡 。
解决办法：缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度 。
2）缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子 ， 而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子 ， 细胞的贴壁效果会下降很多 。
解决办法：更换血清 。
3）支原体或细菌的污染 。
解决办法：分离培养物 ， 检测支原体 。清洁支架或培养箱 。如发现支原体污染 ， 丢弃培养物 。
4）培养液配置、储存不当 ， 如 pH 值过碱 ， Gln 量太少等原因 。
解决办法：使用无菌醋酸溶液调整 pH 值或充入无菌 CO2 。
5）复苏的细胞本身状态不好 ， 已经老化 ， 失去贴附性 。
解决办法：启用新的保种细胞 。
6）如果细胞比较珍贵或没有备份细胞
解决办法：可尝试将不贴壁细胞收集离心 ， 再用 PBS 将沉淀清洗一遍 ， 离心后的沉淀加入胰酶重新消化接种 ， 同时提高血清浓度到 15%~20% 。
BOSTER
三、细胞复苏与冻存
文章图片
复苏
图 6. 细胞复苏流程
1）取出冻存管 ， 立即放入 37°C水浴箱中快速解冻（1 分钟左右） ， 水面不可没过盖子 ， 以避免污染 。
2）将冻存管移至无菌操作内 。打开冻存管 ， 将细胞悬液吸到离心管中 ， 1,000 rpm, 5 min ， 弃上清 。
3）加入适量完全培养基 ， 置于 37°C恒温箱中培养即可 。
4）次日更换一次培养液,以去除任何残留的冷冻保护剂 ， 继续培养 。
冻存
图 6. 细胞冻存流程
1）用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基；
2）加入少量 PBS 冲洗二遍 ， 用胰蛋白酶把单层细胞消化下来 ， 依据传代的方法把细胞 悬液收集于离心管中 ， 离心 1,000 rpm ， 5~8 min；
3）小心弃上清液 ， 加入配置好的冻存培养液 ， 用吸管轻轻吹打使细胞均匀 ， 然后将含有 细胞的冻存液转移到无菌的冻存管中 ， 每个冻存管加液 1~1.5 mL ， 细胞最终密度为 （5~10）×106/mL；
4）冻存管封口 ， 做好标记 ， 按照以下程序冻存：
第一种方法：标准的冻存程序为降温速率 -1~-2℃/min；当温度达到 -25℃ 以下时 ， 可增至 -5℃~-10℃/min；到 -150℃ 时 ， 则可迅速浸入液氮中 。
第二种方法：冻存管放入 4℃ ， 约 30 min,﹣20℃ 30 min-60 min ， 见细胞悬液结冻后 ， 放入 -80 ℃ 冰箱 ， 过夜后转入于液氮罐中 。
第三种方法：将冻存管放于程序降温盒中 ， 并置于 -80℃ 冰箱 4 h 以上 ， 转入液氮罐中长期保存 。
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最后 ， 要着重提醒大家：
除了以上实验操作注意事项 ， 使用合格的细胞产品才是实验成功的第一步 。那么 ， 众所周知 ， 真正合格的细胞产品需要具备：细胞种属污染鉴定、细胞支原体阴性 ， 以及最重要的细胞 STR 鉴定 。
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