细胞|踩坑多年后的吐血经验，终于能养好细胞了( 二 )
#4
细胞胞质疏松 ， 状态不好 ， 养不起来怎么办?
解决办法1：一般情况下 ， 从血清下手就行 ， 要么换好血清 ， 要么提高血清浓度 ， 血清浓度提高到 15%～20% 培养 48 h ， 换成正常 10% 的浓度 ， 用高浓度的血清培养时间过长对细胞有毒性 。
解决办法2：血清下手之后可以同时采取提高细胞密度的方法 ， 从培养瓶换到六孔板 ， 12 孔板等 ， 细胞密度大 ， 细胞分泌的细胞因子多 ， 肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长 。
预防办法：细胞胞质疏松 ， 老化的原因在于细胞传代次数比较多 ， 胰酶消化时间太长 ， 这时候 ， 一定要控制细胞传代次数 ， 注意胰酶消化时间 ， 胰酶消化时间过长 ， 容易导致细胞状态不佳以及胞质疏松 。
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二、细胞传代
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根据细胞生长特性的不同 ， 传代可分为悬浮细胞传代和贴壁细胞传代两种类型 。对于悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代 ， 或用离心法后 ， 加入新培养基后再吹打分散进行传代；贴壁生长的细胞则用消化法进行传代 ， 下面我们将介绍传代培养的一些注意事项 。
#1
贴壁细胞传代如何使用胰酶？
一般使用 trypsin-EDTA 浓度为 0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na 或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na 。
消化液浓度过高时 ， 易造成培养基中细胞碎片增多 ， 黑渣子增多 ， 常规细胞传代时建议用 0.05% 的胰酶进行消化 ， 对于难消化的细胞可采用 0.25% 胰酶进行消化 ， 细胞密度过高超过 80% 时 ， 采用分步消化法 。
胰酶储存在 –20°C ， 解冻在 4°C 进行 ， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中 ， 保存于 –20°C ， 避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低 ， 并可减少污染之机会 。
#2
如何控制胰酶消化时间？
胰酶消化过度会导致细胞碎片增多 ， 黑渣子增多 ， 细胞会成片脱落 ， 严重影响细胞活性 ， 并有部分细胞漂浮 ， 随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难以从瓶壁上吹下 ， 反复吹打则会损伤细胞活性 。因此 ， 控制胰酶消化时间尤为重要 。
不同细胞对消化液的敏感性不同 ， 胰酶消化的时间也会有差异 。对于新购买的细胞 ， 建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间 ， 可每隔 1 分钟镜下观察细胞是否变圆 ， 记录最佳消化时间 ， 下一次操作时参考之前的记录来控制时间即可 。
#3
细胞抱团如何处理？
一些悬浮细胞抱团生长是正常现象 ， 大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下 ， 很可能会出现部分细胞抱团生长的现象 ， 聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物 ， 殃及周围的悬浮细胞 ， 因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度 。
如果出现了细胞团 ， 可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团 ， 也可以尝试以下方法：将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中 ， 静置 20 min 左右 ， 小心取上层细胞上清培养（该方法只能去除部分较大的细胞团） 。
#4
细胞内有空泡 ， 是否是正常现象？
部分细胞本身存在一定的空泡（如 HepG2 ， Ishikawa 及一些耐药株等） ， 这个是正常现象 。如果只有少数细胞有内出现极少空泡 ， 则很可能是细胞状态不佳 ， 可以通过调整血清浓度 ， 控制消化 ， 控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态 。
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